GB 31659.7-2025

分散固相萃取净化,液相色谱串联质谱仪测定,内标法定量. ５ 试剂与材料除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB/T６６８２规定的一级水. ５􀆰１ 试剂 ５􀆰１􀆰１ 乙腈(CH３CN):色谱纯. ５􀆰１􀆰２ 甲醇(CH３OH):色谱纯. ５􀆰１􀆰３ 甲酸(HCOOH):色谱纯. ５􀆰１􀆰４ 氯化钠(NaCl). ５􀆰２ 溶液配制 ５􀆰２􀆰１ ５０％乙腈溶液:取乙腈５０mL,加水稀释至１００mL. ５􀆰３ 标准品 ５􀆰３􀆰１ 氯霉素(Chloramphenicol,C１１H１２Cl ２N２O５,CAS号:５６Ｇ７５Ｇ７),纯度≥９９􀆰０％,或经国家认证并授予标准物质证书的相当者. ５􀆰３􀆰２ 氯霉素ＧD５(ChloramphenicolＧD５,C１１H７D５Cl ２N２O５,CAS号:２０２４８０Ｇ６８Ｇ０),纯度≥９８􀆰０％. ５􀆰４ 标准溶液制备 ５􀆰４􀆰１ 氯霉素标准储备液:取氯霉素标准品适量(相当于活性成分约１０mg),精密称定,用甲醇适量使溶解并稀释定容至１０mL容量瓶中,配制成浓度为１mg/mL标准储备液,－１８℃以下避光保存,有效期１２ 个月. ５􀆰４􀆰２ 内标储备液:取氯霉素ＧD５标准品约１mg,精密称定,用甲醇适量使溶解并稀释定容至１０mL 容量瓶中,配制成浓度为１００μg/mL内标储备液,－１８℃以下避光保存,有效期１２个月. １ GB３１６５９􀆰７—２０２５ ５􀆰４􀆰３ 氯霉素标准中间液:精密量取氯霉素标准储备液１mL,于１００mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度, 配制成浓度为１０μg/mL标准中间液,－１８℃以下避光保存,有效期６个月. ５􀆰４􀆰４ 内标中间液:精密量取内标储备液１mL,于１００mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成浓度为 １μg/mL内标中间液,－１８℃以下避光保存,有效期６个月. ５􀆰４􀆰５ 氯霉素标准工作液:精密量取氯霉素标准中间液１００μL,于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度, 配制成浓度为１００ng/mL的标准工作液,０℃~４℃避光保存,有效期７d. ５􀆰４􀆰６ 内标工作液:精密量取内标中间液２００μL,于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释定容至刻度,配制成浓度为２０ng/mL的内标工作液,０℃~４℃避光保存,有效期７d. ５􀆰５ 材料 ５􀆰５􀆰１ 乙二胺ＧNＧ丙基硅烷化硅胶(PSA):粒径４０μm. ５􀆰５􀆰２ 十八烷基硅烷键合硅胶(C１８):粒径４０μm. ５􀆰５􀆰３ 尼龙微孔滤膜:０􀆰２２μm,或相当者. ６ 仪器和设备 ６􀆰１ 液相色谱串联质谱仪:配电喷雾离子源. ６􀆰２ 分析天平:感量分别为０􀆰００００１g和０􀆰０１g. ６􀆰３ 氮气吹干仪. ６􀆰４ 涡旋混合器. ６􀆰５ 快速振荡器. ６􀆰６ 匀浆机. ６􀆰７ 离心机:离心力不小于７１００×g(或转速不低于８０００r/min). ７ 试样的制备与保存 ７􀆰１ 试样的制备取适量新鲜的空白或供试禽蛋,去壳,于匀浆机充分混匀. a) 取混匀后的供试样品,作为供试试样; b) 取混匀后的空白样品,作为空白试样; c) 取混匀后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作溶液,作为空白添加试样. ７􀆰２ 试样的保存 －１８℃以下保存. ８ 测定步骤 ８􀆰１ 提取称取试料(１０±０􀆰０５)g,于５０mL离心管中,加入１００μL２０ng/mL 的内标工作溶液、１６mL 乙腈、 ５􀆰０g氯化钠,涡旋混匀１min,剧烈振荡１０min,７１００×g 离心１０min,取乙腈层备用. ８􀆰２ 净化取备用液至混有６００mgPSA 和６００mgC１８的５０mL 离心管中,剧烈振荡１０min,７１００×g 离心 １０min.取上清液于４０℃氮气吹干,加入２mL５０％乙腈溶液,涡旋３０s,过０􀆰２２μm 滤膜,供液相色谱串联质谱仪测定. ８􀆰３ 标准曲线的制备精确量取氯霉素和氯霉素ＧD５标准工作液适量,用５０％乙腈溶液稀释,配制成氯霉素浓度为０􀆰５μg/L、 １μg/L、２􀆰５μg/L、５μg/L、１０μg/L、２５μg/L,氯霉素ＧD５浓度均为１μg/L系列标准溶液,临用现配,供液相色谱串联质谱测定.以氯霉素和氯霉素ＧD５定量离子对的峰面积比为纵坐标、氯霉素标准溶液浓度为 ２ GB３１６５９􀆰７—２０２５ 横坐标,绘制标准曲线,求回归方程和相关系数. ８􀆰４ 测定 ８􀆰４􀆰１ 液相色谱参考条件 a) 色谱柱:C１８色谱柱(１００mm×３􀆰０mm,３􀆰０μm),或相当者; b) 柱温:３０℃; c) 流速:０􀆰３mL/min; d) 进样量:１０μL; e) 流动相:A 为水,B为乙腈,梯度洗脱程序见表１. 表１ 梯度洗脱程序时间 min A ％ B ％ ０􀆰０ ９０ １０ １􀆰５ ７０ ３０ ５􀆰０ １０ ９０ ８􀆰０ １０ ９０ ８􀆰１ ９０ １０ １２􀆰０ ９０ １０ ８􀆰４􀆰２ 质谱参考条件 a) 离子源:电喷雾离子源(ESI); b) 扫描方式:负离子扫描; c) 检测方式:多反应监测(MRM); d) 喷雾电压:－４５００V; e) 温度:５５０℃; f) 气帘气:０􀆰２４MPa; g) 雾化气:０􀆰２１MPa; h) 辅助加热气:０􀆰２１MPa; i) 氯霉素及氯霉素ＧD５定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量参考值见表２. 表２ 氯霉素及氯霉素ＧD５定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量参考值化合物名称定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 氯霉素 ３２１􀆰０＞１５２􀆰０ ３２１􀆰０＞２５７􀆰０ ３２１􀆰０＞１５２􀆰０ ７０ ２４ １７ 氯霉素ＧD５ ３２６􀆰１＞１５７􀆰０ ３２６􀆰１＞１５７􀆰０ ７０ ２５ ８􀆰４􀆰３ 测定法 ８􀆰４􀆰３􀆰１ 定性测定在相同测试条件下,试样溶液中氯霉素与其同位素内标(氯霉素ＧD５)的保留时间之比与标准溶液中氯霉素与其同位素内标(氯霉素ＧD５)的保留时间之比偏差在１％以内;且检测到的相对离子丰度应当与浓度相当的校正标准溶液相对离子丰度一致,其允许偏差为±４０％. ８􀆰４􀆰３􀆰２ 定量测定取试样溶液和相应的标准溶液,作单点或多点校准,按内标法定量.试样溶液及标准溶液中氯霉素与氯霉素ＧD５的响应值均应在仪器检测的线性范围之内.对于试料中氯霉素残留量超过仪器测定线性范围的,在提取时根据药物浓度相应增加内标工作液的添加量,使试样溶液稀释后氯霉素的响应在仪器线性范围内,对应氯霉素ＧD５浓度与标准曲线制备中的氯霉素ＧD５浓度一致.在上述色谱质谱条件下,氯霉素和 ３ GB３１６５９􀆰７—２０２５ 氯霉素ＧD５标准溶液特征离子对质量色谱图见附录A. ８􀆰５ 空白试验称取空白试样,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作. ９ 结果计算和表述试样中氯霉素的残留量按标准曲线或公式(１)计算. X ＝Cs×Cis×Ai ×A′is×V C′is×As×Ais×m (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: X ———试样中氯霉素残留量的数值,单位为微克每千克(μg/kg); Cs ———标准溶液中氯霉素浓度的数值,单位为微克每升(μg/L); Cis ———试样溶液中氯霉素ＧD５浓度的数值,单位为微克每升(μg/L); Ai ———试样溶液中氯霉素的峰面积; A′is———标准溶液中氯霉素ＧD５的峰面积; V ———定容体积的数值,单位为毫升(mL); C′is———标准溶液中氯霉素ＧD５浓度的数值,单位为微克每升(μg/L); As ———标准溶液中氯霉素的峰面积; Ais ———试样溶液中氯霉素ＧD５的峰面积; m ———供试试样质量的数值,单位为克(g). 注:计算结果以平行测定结果的算术平均值表示,含量不小于１μg/kg的保留３位有效数字,１μg/kg以下保留至小数点后２位. １０ 方法的灵敏度、正确度和精密度 １０􀆰１ 灵敏度本方法氯霉素检出限为０􀆰０５μg/kg;定量限为０􀆰１μg/kg. １０􀆰２ 正确度本方法在０􀆰１μg/kg~１􀆰０μg/kg的添加浓度水平时,氯霉素回收率为７０％~１２０％. １０􀆰３ 精密度本方法批内相对标准偏差≤１５％,批间相对标准偏差≤１５％. ４ GB３１６５９􀆰７—２０２５ 附录 A (资料性) 氯霉素及氯霉素ＧD５标准溶液特征离子对质量色谱图氯霉素及氯霉素ＧD５标准溶液的特征离子对质量色谱图见图A􀆰１. 标引序号说明: １———氯霉素定量离子对质量色谱图(３２１􀆰０/１５２􀆰０); ２———氯霉素定性离子对质量色谱图(３２１􀆰０/２５７􀆰０); ３———氯霉素ＧD５特征离子对质量色谱图(３２６􀆰１/１５７􀆰０). 图A􀆰１ 氯霉素及氯霉素ＧD５标准溶液(浓度均为０􀆰５μg/L)特征离子对质量色谱图 ５