GB 5009.309-2025

3. 1. 5 无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)。 3. 1. 6 盐酸甲胺(CH5N·HCl)。 3. 1. 7 三羟甲基氨基甲烷(Tris碱,C4H11O3N)。 3. 1. 8 灰色链霉菌蛋白酶(XIV 型;来源于灰色链霉菌):酶活力≥3. 5U/mg。 3. 1. 9 磷酸(H3PO4):色谱纯,含量≥85%。 3. 1. 10 浓盐酸(HCl)。 3. 2 试剂配制 3. 2. 1 丹磺酰氯溶液(2. 0g/L):称取0. 2g丹磺酰氯,用乙腈溶解并定容至100mL,现配现用。 3. 2. 2 盐酸溶液(1. 0mol/L):吸取8. 3mL浓盐酸,加水稀释至100mL。 3. 2. 3 Tris缓冲液(0. 05mol/L):称取6. 06g三羟甲基氨基甲烷于1000mL烧杯中,加水800mL溶解,用1. 0mol/L盐酸溶液调节pH 至8. 0±0. 1,用水稀释至1000mL。4 ℃保存,有效期1个月。 1 GB5009. 309—2025 3. 2. 4 蛋白酶溶液(52. 5U/mL):称取0. 15g灰色链霉菌蛋白酶,用Tris缓冲液溶解并定容至10mL。 现配现用。 3. 2. 5 碳酸钠缓冲溶液(60mmol/L):称取0. 318g无水碳酸钠,加40mL 水溶解,用1. 0mol/L 盐酸溶液调pH 至9. 5±0. 1,用水定容至50mL。现配现用。 3. 2. 6 盐酸甲胺溶液(20g/L):称取2. 0g盐酸甲胺,用水溶解并定容至100 mL。4 ℃保存,有效期 3个月。 3. 2. 7 磷酸氢二钠溶液(10mmol/L):称取无水磷酸氢二钠1. 42g,用800mL水溶解,用磷酸调节pH 至6. 5±0. 1,用水稀释至1000mL。 3. 2. 8 20%甲醇溶液:量取20mL甲醇,加水稀释至100mL。 3. 3 标准品 3. 3. 1 天冬酰胺标准品(C4H8N2O3,CAS号:70-47-3):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 3. 3. 2 谷氨酰胺标准品(C5H10N2O3,CAS号:56-85-9):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 3. 4 标准溶液配制 3. 4. 1 天冬酰胺标准储备液(2. 00mg/mL):准确称取100mg(精确至0. 0001g)天冬酰胺标准品,用 20%甲醇溶液溶解并定容至50mL。4 ℃避光保存,有效期3个月。 3. 4. 2 谷氨酰胺标准储备液(2. 00mg/mL):准确称取100mg(精确至0. 0001g)谷氨酰胺标准品,用 20%甲醇溶液溶解并定容至50mL。4 ℃避光保存,有效期3个月。 3. 4. 3 混合标准中间液(20. 0μg/mL):分别准确吸取天冬酰胺和谷氨酰胺标准储备液各1. 00 mL 于 100mL容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。现配现用。 3. 4. 4 混合标准系列工作液:分别准确吸取适量混合标准中间液(20. 0μg/mL)于10mL容量瓶中,用水定容至刻度,获得质量浓度分别为0μg/mL、0. 500μg/mL、1. 00μg/mL、2. 00μg/mL、5. 00μg/mL、 10. 0μg/mL和20. 0μg/mL的标准系列工作液。现配现用。 3. 5 材料 3. 5. 1 螺纹带盖玻璃瓶:20mL。 3. 5. 2 有机微孔滤膜:0. 22μm。 4 仪器和设备 4. 1 高效液相色谱仪:配紫外检测器或二极管阵列检测器。 4. 2 电子天平:感量0. 001g和0. 0001g。 4. 3 涡旋混合器。 4. 4 恒温水浴装置:37 ℃±1 ℃。 4. 5 pH 计:精度0. 01。 4. 6 离心机:转速≥5000r/min。 5 分析步骤 5. 1 试样制备非粉状固体试样粉碎并混合均匀,粉状固体试样或液体试样摇匀。 2 GB5009. 309—2025 5. 2 试样提取 5. 2. 1 直接提取法固体试样称取5. 0g(精确至0. 001g)于50mL干燥烧杯中,加适量温水(40 ℃~45 ℃)溶解,冷却至室温后转移并定容至25mL。准确移取1. 00mL于150mL锥形瓶中,加入约25mL水涡旋混匀,用 1. 0mol/L盐酸溶液调节pH 至4. 5±0. 1,然后转移至250mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀,离心或者过滤得到待衍生试样溶液。 液体试样称取1. 0g~5. 0g(精确至0. 001g)于150mL锥形瓶中,后续操作步骤同固体试样。 5. 2. 2 酶解提取法固体试样称取5. 0g(精确至0. 001g)于50mL干燥烧杯中,加适量温水(40 ℃~45 ℃)溶解,冷却至室温后转移并定容至25mL。准确移取1. 00mL于20mL螺纹带盖玻璃瓶中,依次加入0. 5mL 蛋白酶溶液、3. 0mLTris缓冲液、0. 2mL甲醇,涡旋混匀,于37℃恒温水浴酶解16h。取出玻璃瓶,冷却至室温,将酶解液全部转移至250mL容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。离心或者过滤得到待衍生试样溶液。 液体试样称取0. 5g~1. 0g(精确至0. 001g)于20mL 螺纹带盖玻璃瓶中,后续操作步骤同固体试样。 5. 3 衍生反应准确吸取待衍生试样溶液1. 00mL至15mL离心管中,加入1. 00mL碳酸钠缓冲溶液和1. 00mL 丹磺酰氯溶液,充分混合,室温避光反应2h(反应约1h时取出振摇均匀),加入0. 10mL盐酸甲胺溶液涡旋混合,终止反应,避光静置至沉淀完全,经0. 22μm 滤膜过滤,待测。 另准确吸取1. 00mL混合标准系列工作液,与待衍生试样溶液同步进行衍生。 5. 4 仪器参考条件色谱参考条件如下: a) 色谱柱:C18色谱柱(250mm×4. 6mm,5μm)或性能相当者; b) 流动相A 为10mmol/L磷酸氢二钠溶液,流动相B为甲醇,梯度洗脱条件见表1; c) 流速:1. 0mL/min; d) 柱温:35 ℃; e) 检测波长:247nm; f) 进样量:10μL。 表1 梯度洗脱条件时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0. 0 70 30 17. 0 70 30 17. 1 20 80 19. 0 20 80 19. 1 70 30 24. 0 70 30 3 GB5009. 309—2025 5. 5 标准曲线的制作将衍生后的混合标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中,以混合标准系列工作液中天冬酰胺或谷氨酰胺的质量浓度为横坐标,以天冬酰胺衍生物或谷氨酰胺衍生物的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线。标准溶液衍生后的色谱图见附录A 中图A. 1。 5. 6 试样溶液的测定将衍生后的待测液注入高效液相色谱仪中,得到相应的峰面积,根据标准曲线得到试样溶液中天冬酰胺或谷氨酰胺的质量浓度。待测液中目标化合物的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应对待衍生试样溶液进行稀释,重新按样品衍生分析步骤处理后再进样分析。 5. 7 空白试验除不加试样外,其他操作与样品的操作一致。 6 分析结果的表述 6. 1 游离态天冬酰胺和游离态谷氨酰胺直接提取法试样中游离态天冬酰胺、游离态谷氨酰胺的含量按公式(1)计算: X =ρ×V ×f m ×1000 …………………………(1) 式中: X ———试样中游离态天冬酰胺、游离态谷氨酰胺的含量,单位为毫克每克(mg/g); ρ ———由标准曲线得到的试样溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/ mL); V ———试样最终定容体积,单位为毫升(mL); f ———稀释因子; m ———试样质量,单位为克(g); 1000———单位换算系数。 计算结果保留3位有效数字。 6. 2 天冬酰胺总量和谷氨酰胺总量酶解提取法试样中天冬酰胺总量、谷氨酰胺总量按公式(2)计算: X = ( ρ-ρ0)×V ×f m ×1000 …………………………(2) 式中: X ———试样中天冬酰胺总量、谷氨酰胺总量,单位为毫克每克(mg/g); ρ ———由标准曲线得到的试样溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/ mL); ρ0 ———由标准曲线得到的空白试验溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的质量浓度,单位为微克每毫升 (μg/mL); V ———试样最终定容体积,单位为毫升(mL); f ———稀释因子; m ———试样质量,单位为克(g); 4 GB5009. 309—2025 1000———单位换算系数。 计算结果保留3位有效数字。 7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 8 其他当固体试样称样量为5. 0g时,方法检出限均为0. 2mg/g,定量限均为0. 6mg/g;当液体试样称样量为1. 0g时,方法检出限均为0. 04mg/g,定量限均为0. 12mg/g。 第二法液相色谱-串联质谱法 9 原理试样经灰色链霉菌蛋白酶酶解,稀释后用液相色谱-串联质谱法测定,同位素内标法定量。 10 试剂和材料除另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 10. 1 试剂 10. 1. 1 甲酸(CH2O2):色谱纯。 10. 1. 2 甲醇(CH4O):色谱纯。 10. 1. 3 乙腈(C2H3N):色谱纯。 10. 1. 4 三羟甲基氨基甲烷(Tris碱,C4H11O3N)。 10. 1. 5 灰色链霉菌蛋白酶(XIV 型,来源于灰色链霉菌):酶活力≥3. 5U/mg。 10. 1. 6 浓盐酸(HCl)。 10. 2 试剂配制 10. 2. 1 0. 02%甲酸溶液:吸取0. 2mL甲酸,溶于1L水中,混匀。 10. 2. 2 盐酸溶液(1. 0mol/L):同3. 2. 2。 10. 2. 3 Tris缓冲液(0. 05mol/L):同3. 2. 3。 10. 2. 4 蛋白酶溶液(52. 5U/mL):同3. 2. 4。 10. 2. 5 20%甲醇溶液:同3. 2. 8。 10. 3 标准品 10. 3. 1 天冬酰胺标准品(C4H8N2O3,CAS号:70-47-3):同3. 3. 1。 10. 3. 2 谷氨酰胺标准品(C5H10N2O3,CAS号:56-85-9):同3. 3. 2。 10. 3. 3 天冬酰胺同位素内标(天冬酰胺水合物- 15N2,C4H8 15N2O3·H2O,CAS号:287484-32-6):纯度 ≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 5 GB5009. 309—2025 10. 3. 4 谷氨酰胺同位素内标(谷氨酰胺- 15N2,C5H10 15N2O3,CAS号:204451-48-9):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。 10. 4 标准溶液配制 10. 4. 1 天冬酰胺标准储备液(2. 00mg/mL):同3. 4. 1。 10. 4. 2 谷氨酰胺标准储备液(2. 00mg/mL):同3. 4. 2。 10. 4. 3 天冬酰胺- 15N2 内标储备液(2. 00mg/mL):准确称取114mg(精确至0. 0001g)天冬酰胺水合物- 15N2 标准品,用20%甲醇水溶解并定容至50mL。4 ℃避光保存,有效期3个月。 10. 4. 4 谷氨酰胺- 15N2 内标储备液(2. 00mg/mL):准确称取100mg(精确至0. 0001g)谷氨酰胺- 15N2 标准品,用20%甲醇水溶解并定容至50mL。4 ℃避光保存,有效期3个月。 10. 4. 5 同位素内标混合溶液:分别准确吸取天冬酰胺- 15N2 和谷氨酰胺- 15N2 内标储备液各1. 00 mL 于1000mL容量瓶中,用水定容至刻度。现配现用。 10. 4. 6 混合标准中间液(1. 00μg/mL):准确吸取2. 50mL 质量浓度为20. 0μg/mL 的混合标准溶液 (3. 4. 3)于50mL容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。现配现用。 10. 4. 7 混合标准系列工作液:分别准确吸取适量混合标准中间液(1. 00μg/mL)和1. 00mL 同位素内标混合溶液于10mL容量瓶中,用水定容至刻度,混匀,即得质量浓度分别为0ng/mL、10. 0ng/mL、 20. 0ng/mL、50. 0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL 和1000ng/mL 的混合标准系列工作液。现配现用。 注:可根据样品中实际质量浓度情况选择标准曲线范围,但至少包含6个质量浓度点(含0点)。 10. 5 材料 10. 5. 1 螺纹带盖玻璃瓶:20mL。 10. 5. 2 水系微孔滤膜:0. 22μm。 11 仪器和设备 11. 1 液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾(ESI)离子源。 11. 2 电子天平:感量分别为0. 001g和0. 0001g。 11. 3 涡旋混合器。 11. 4 恒温水浴装置:37 ℃±1 ℃。 11. 5 pH 计:精度0. 01。 11. 6 离心机:转速≥5000r/min。 12 分析步骤 12. 1 试样制备非粉状固体试样粉碎并混合均匀,粉状固体试样或液体试样摇匀。 12. 2 试样提取酶解:试样酶解过程同5. 2. 2。 稀释:准确移取1. 00mL上述待衍生试样溶液至10mL 容量瓶中,加入1. 00mL 同位素内标混合溶液(10. 4. 5),用水定容至刻度。混匀后,经0. 22μm 滤膜过滤,待测。 注:可根据样品中实际浓度情况调整移取体积。 6 GB5009. 309—2025 12. 3 仪器参考条件 12. 3. 1 色谱参考条件色谱参考条件如下: a) 色谱柱:亲水改性C18色谱柱(150mm×4. 6mm,2. 6μm)或性能相当者; b) 流动相A 为0. 02%甲酸溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱条件见表2; c) 流速:0. 3mL/min; d) 柱温:35 ℃; e) 进样体积:5μL。 表2 梯度洗脱条件时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0. 0 80 20 0. 5 80 20 6. 0 50 50 6. 1 20 80 7. 0 20 80 7. 1 80 20 10. 0 80 20 12. 3. 2 质谱参考条件质谱参考条件如下: a) 离子化模式:电喷雾正离子电离(ESI + ); b) 扫描方式:多反应监测模式(MRM); c) 雾化气温度:300 ℃; d) 离子源温度:250 ℃; e) 喷雾电压:3500V; f) 鞘气流速:12. 6L/min; g) 辅助气流速:3. 0L/min; h) 天冬酰胺、谷氨酰胺及其内标物的定量和定性离子、碰撞能量和透镜电压参数见表3。 表3 质谱参数化合物母离子(m/z) 子离子(m/z) 碰撞能量/eV 透镜电压/V 天冬酰胺 132. 9 73. 9 15 87. 1 * 10 54 谷氨酰胺 146. 9 84. 0 * 16 130. 0 10 61 天冬酰胺- 15N2 134. 9 88. 9 * 10 55 谷氨酰胺- 15N2 149. 0 85. 0 * 10 61 定性和定量离子可根据仪器进行调整 * 定量离子。 7 GB5009. 309—2025 12. 4 标准曲线的制作将混合标准系列工作液分别注入液相色谱-串联质谱仪中,以混合标准系列工作液中天冬酰胺或谷氨酰胺的质量浓度为横坐标,以天冬酰胺或谷氨酰胺与其对应同位素内标的峰面积比值为纵坐标,分别绘制标准曲线。标准溶液多反应监测(MRM)色谱图见图A. 2。 12. 5 试样溶液的测定 12. 5. 1 定性判定在相同测试条件下,试样中的天冬酰胺和谷氨酰胺色谱峰保留时间与标准工作溶液相比,偏差范围在±2. 5%以内,且检测到的离子的相对离子比率,应当与浓度相当的标准工作液相对离子比率一致。 其允许偏差应符合表4的要求。 表4 定性确证时相对离子比率的允许偏差范围相对离子比率 >50% >20%~50% >10%~20% ≤10% 允许相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 12. 5. 2 定量测定将待测液注入液相色谱-串联质谱仪中,得到相应的峰面积比值,根据标准曲线得到试样溶液中天冬酰胺或谷氨酰胺的质量浓度。 12. 6 空白试验除不加试样外,其他操作与样品的操作一致。 13 分析结果的表述试样中天冬酰胺总量、谷氨酰胺总量按式(3)计算: X = ( ρ-ρ0)×V ×f m ×1000×1000 …………………………(3) 式中: X ———试样中天冬酰胺总量、谷氨酰胺总量,单位为毫克每克(mg/g); ρ ———由标准曲线得到的试样溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的质量浓度,单位为纳克每毫升(ng/ mL); ρ0 ———由标准曲线得到的空白试验溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的质量浓度,单位为纳克每毫升 (ng/mL); V ———试样最终定容体积,单位为毫升(mL); f ———稀释因子; m ———试样质量,单位为克(g); 1000———单位换算系数。 计算结果保留3位有效数字。 8 GB5009. 309—2025 14 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 15 其他当固体试样称样量为5. 0g时,方法检出限均为0. 04mg/g,定量限均为0. 12mg/g;当液体试样称样量为1. 0g时,方法检出限均为0. 008mg/g,定量限均为0. 024mg/g。 9 GB5009. 309—2025 附录 A 色谱图天冬酰胺和谷氨酰胺标准溶液衍生物的液相色谱图见图A. 1。 说明: 1———天冬酰胺衍生物; 2———谷氨酰胺衍生物。 图A. 1 天冬酰胺和谷氨酰胺(10μg/mL)标准溶液衍生物的液相色谱图 0 1 GB5009. 309—2025 天冬酰胺和谷氨酰胺标准溶液及其内标的液相色谱-串联质谱MRM 图见图A. 2。 说明: 1———天冬酰胺132. 9>73. 9; 2———天冬酰胺132. 9>87. 1; 3———天冬酰胺- 15N2134. 9>88. 9; 4———谷氨酰胺146. 9>84. 0; 5———谷氨酰胺146. 9>130. 0; 6———谷氨酰胺- 15N2149. 0>85. 0。 图A. 2 天冬酰胺和谷氨酰胺标准溶液及其内标(200ng/mL)的液相色谱-串联质谱MRM 图 1 1 GB5009. 309—2025