GB 31658.28-2025

:色谱纯. ５􀆰１􀆰５ 萃取盐包:含４gNa２SO４、１gNaCl. ５􀆰１􀆰６ βＧ葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(βＧGlucuronidase/arylsulfatase),１００００U/mL. ５􀆰２ 溶液配制 ５􀆰２􀆰１ ６０％乙腈溶液:取乙腈６００mL,用水稀释至１０００mL. ５􀆰２􀆰２ ２mol/L乙酸铵溶液:取乙酸铵１５􀆰４g,用水溶解并定容至１００mL,用适量乙酸调pH 至５􀆰２. ５􀆰２􀆰３ ０􀆰２mol/L乙酸铵缓冲液:取２mol/L乙酸铵溶液１０mL,用水稀释至１００mL,用适量乙酸调pH 至５􀆰２. ５􀆰２􀆰４ ２mmol/L 乙酸铵溶液(含０􀆰１％甲酸):取甲酸１mL、２mol/L 乙酸铵溶液１mL,用水稀释至 １０００mL. ５􀆰２􀆰５ ０􀆰１％甲酸乙腈溶液:取甲酸１mL,用乙腈稀释至１０００mL. ５􀆰３ 标准品醋酸氟孕酮(Flurogestoneacetate,FGA)、醋酸甲地孕酮(Megestrolacetate,MA)、醋酸美仑孕酮 １ GB３１６５８􀆰２８—２０２５ (Melengestrolacetate,MGA)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinoneacetate,CMA)、醋酸羟孕酮(HydroxyproＧ gesteroneacetate,HPA)、醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesteroneacetate,MPA)含量≥９９％.化合物信息见附录A. ５􀆰４ 标准溶液制备 ５􀆰４􀆰１ 标准储备液:取乙酰孕激素标准品各１０mg,精确至０􀆰１mg,加甲醇使溶解并定容至１０mL,配制成浓度均为１mg/mL的标准储备液.－１８℃以下保存,有效期３个月. ５􀆰４􀆰２ 中间浓度混合标准溶液:取乙酰孕激素标准储备液各适量,于同一１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成浓度为５０μg/mL的中间浓度混合标准溶液.醋酸甲羟孕酮单独配制浓度为５０μg/mL的中间浓度标准溶液.４℃~８℃保存,有效期１周. ５􀆰４􀆰３ 混合标准工作液:取适量中间浓度混合标准溶液于１０mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,配制成浓度为１μg/mL的标准工作液.醋酸甲羟孕酮单独配制浓度为１μg/mL的标准工作液.现用现配. ５􀆰５ 材料 ５􀆰５􀆰１ 增强型脂肪去除固相萃取柱或性能相当者. ５􀆰５􀆰２ 滤膜:有机系,０􀆰２μm. ６ 仪器和设备 ６􀆰１ 液相色谱Ｇ串联质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI). ６􀆰２ 天平:感量０􀆰０１g. ６􀆰３ 分析天平:感量０􀆰００００１g. ６􀆰４ 均质机. ６􀆰５ 涡旋混合器. ６􀆰６ 振荡器. ６􀆰７ 冷冻离心机:１００００r/min或以上. ６􀆰８ 氮吹仪. ６􀆰９ 超声仪. ６􀆰１０ pH 计. ７ 试样的制备与保存 ７􀆰１ 试样的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎并使均质.取适量新鲜或解冻的空白或供试牛羊奶样品, 均质或混合均匀.奶粉按１∶５重量比还原成液态奶进行测定.取适量新鲜或冷藏的空白或供试鸡蛋,去壳后混合均匀.尿液样品取样后应在－１８℃以下保存.试验前取适量恢复至室温,混匀备用. a) 取均质的供试样品,作为供试试样; b) 取均质的空白样品,作为空白试样; c) 取均质的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试样. ７􀆰２ 试样的保存 －１８℃以下保存. ８ 测定步骤 ８􀆰１ 酶解与提取取组织和鸡蛋样品(５±０􀆰０５)g,加入０􀆰２mol/L 乙酸铵缓冲溶液(pH＝５􀆰２)３mL.取奶样(５± ０􀆰０５)g,奶粉样品(１±０􀆰０１)g(按７􀆰１还原为液态奶),加入２mol/L乙酸铵溶液(pH＝５􀆰２)０􀆰５mL.取尿液５mL(±０􀆰０５mL),加入２mol/L乙酸铵缓冲溶液(pH＝５􀆰２)０􀆰５mL,充分混匀.再加入βＧ葡萄糖 ２ GB３１６５８􀆰２８—２０２５ 醛苷酶/芳基硫酸酯酶１００μL混合,于５５℃下避光水浴振荡２h.取出后放置至室温,涡旋混匀１min, 加入乙腈１０mL,涡旋混匀１min,加入萃取盐包,涡旋混匀１min~２min,于－１８℃冷冻３０min,４℃ ９０００r/min离心５min.准确量取上层溶液４mL于另一１０mL离心管,加水１mL,涡旋混匀.备用. ８􀆰２ 净化取备用液过固相萃取柱,收集全部流出液于离心管中,于４０℃下氮吹至近干,用６０％乙腈水溶液 １􀆰０mL溶解,充分涡旋,０􀆰２μm 滤膜过滤(如遇到样品浑浊,可先１００００r/min离心５min,然后滤膜过滤).滤液供液相色谱Ｇ串联质谱测定. ８􀆰３ 基质匹配标准曲线的制备取空白试样,按８􀆰１和８􀆰２处理样品,获得试样空白基质溶液.分别精密量取适量乙酰孕激素标准工作液,配制成浓度为０􀆰５μg/L、１μg/L、２μg/L、５μg/L、１０μg/L 和２０μg/L(醋酸甲羟孕酮为１μg/L、 ２μg/L、４μg/L、１０μg/L、２０μg/L和４０μg/L)的系列标准溶液各１mL,吹干后用１mL试样空白基质溶液复溶,配制成基质匹配系列标准溶液,供液相色谱串联质谱测定.以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标、对应的基质匹配标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线.求回归方程和相关系数. ８􀆰４ 测定 ８􀆰４􀆰１ 色谱参考条件 a) 色谱柱:C１８(１００mm×３􀆰０mm,２􀆰７μm),或相当者; b) 流动相:A 为２mmol/L乙酸铵０􀆰１％甲酸溶液,B为０􀆰１％甲酸乙腈溶液; c) 流速:０􀆰４mL/min; d) 进样量:１０μL; e) 柱温:４０℃; f) 梯度洗脱程序见表１. 表１ 梯度洗脱程序时间 min A ％ B ％ ０􀆰０ ４０􀆰０ ６０􀆰０ ４􀆰０ １０􀆰０ ９０􀆰０ ６􀆰０ ０􀆰０ １００􀆰０ ６􀆰１ ４０􀆰０ ６０􀆰０ ８􀆰０ ４０􀆰０ ６０􀆰０ ８􀆰４􀆰２ 质谱参考条件 a) 离子源:电喷雾离子源(ESI); b) 扫描方式:正离子扫描; c) 检测方式:多反应监测(MRM); d) 离子源温度:５００℃; e) 喷雾电压(IS):５５００V; f) 碰撞气压力(CAD):３４􀆰４７４kPa(５psi); g) 气帘气压力:２４１􀆰３２kPa(３５psi); h) 雾化气压力:３４４􀆰７５kPa(５０psi); i) 辅助气压力:３４４􀆰７５kPa(５０psi); j) 监测离子参数情况见表２. 表２ 乙酰孕激素特征离子参考质谱条件化合物母离子 m/z 子离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 醋酸氟孕酮 (FGA) ４０７􀆰３ ２６７􀆰１ ∗ ２２５􀆰０ １３０ ４０ ４０ ３ GB３１６５８􀆰２８—２０２５ 表２(续) 化合物母离子 m/z 子离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 醋酸甲地孕酮 (MA) ３８５􀆰４ ２６７􀆰０ ∗ ３２５􀆰２ １１０ ２５ ２５ 醋酸美仑孕酮 (MGA) ３９７􀆰４ ２７９􀆰１ ∗ ３３７􀆰３ ９５ ２５ ２５ 醋酸氯地孕酮 (CMA) ４０５􀆰３ ３０９􀆰２ ∗ ３４５􀆰１ ９０ ２５ ２５ 醋酸甲羟孕酮 (MPA) ３８７􀆰１ ２８５􀆰２ ∗ ３２７􀆰２ １００ ２８ ３０ 醋酸羟孕酮 (HPA) ３７３􀆰４ ２７１􀆰２ ∗ ３１３􀆰１ ９０ ２８ ２８ ∗ 为定量离子. ８􀆰５ 测定法 ８􀆰５􀆰１ 定性测定通过试样溶液被测物色谱图的保留时间与相应标准溶液的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度基质匹配标准溶液各色谱峰的特征离子相对照定性.试样溶液与标准溶液被测物保留时间偏差在±０􀆰１min以内;且检测到的相对离子丰度应与浓度相当的校正标准溶液相对离子丰度一致,其允许偏差为±４０％. ８􀆰５􀆰２ 定量测定按外标法计算试样中乙酰孕激素的残留量.实测试样采用单点或多点校正的方式定量;对于超过标准曲线最高点浓度的样品,用空白基质溶液将样品稀释到线性范围内后进行定量.乙酰孕激素类６种药物标准溶液定量离子色谱图见附录B. ８􀆰６ 空白试验取空白试样,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行测定. ９ 结果计算和表述组织、奶及奶粉、鸡蛋样品和尿液样品中乙酰孕激素类药物的残留量按公式(１)计算. X ＝A ×Cs×V１×V２ As×m ×V３ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: X ———组织、奶及奶粉、鸡蛋样品和尿液样品中乙酰孕激素类药物残留量的数值,单位为微克每千克 (μg/kg)和微克/升(μg/L); A ———试样溶液中相应的乙酰孕激素的峰面积; Cs ———基质标准溶液中相应乙酰孕激素浓度的数值,单位微克每升(μg/L); V１———提取步骤中使用提取液乙腈体积的数值,单位毫升(mL); V２———提取液氮吹浓缩后的残留液定容体积的数值,单位毫升(mL); As———基质标准溶液中相应的乙酰孕激素的峰面积; m ———供试试料质量的数值,单位克(g); V３———净化所用提取液体积的数值,单位毫升(mL). 注:计算结果以平行测定结果的算术平均值表示,含量不小于１μg/kg的保留３位有效数字,１μg/kg以下保留至小数点后２位. １０ 检测方法的灵敏度、准确度和精密度 １０􀆰１ 灵敏度本方法猪、牛、羊、鸡的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏组织,牛奶、羊奶、鸡蛋、猪尿、牛尿中醋酸氟孕酮、醋酸甲 ４ GB３１６５８􀆰２８—２０２５ 地孕酮、醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸羟孕酮的检出限为０􀆰２μg/kg(尿液为０􀆰２μg/L),定量限为 ０􀆰５μg/kg(尿液为０􀆰５μg/kg);醋酸甲羟孕酮检出限为０􀆰４μg/kg(０􀆰４μg/kg),定量限为１􀆰０μg/kg(尿液为１􀆰０μg/kg). 奶粉中醋酸氟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸羟孕酮的检出限为１μg/kg, 定量限为２􀆰５μg/kg.醋酸甲羟孕酮的检出限为２μg/kg,定量限为５μg/kg. １０􀆰２ 正确度本方法猪、牛、羊、鸡的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏组织,牛奶、羊奶、鸡蛋、猪尿、牛尿在０􀆰５μg/kg~ ２􀆰５μg/kg(醋酸甲羟孕酮在１􀆰０μg/kg~５􀆰０μg/kg)添加水平下,奶粉在２􀆰５μg/kg~１２􀆰５μg/kg(醋酸甲羟孕酮在５􀆰０μg/kg~２５􀆰０μg/kg)添加水平下,乙酰孕激素平均回收率范围为６０％~１２０％. １０􀆰３ 精密度本方法批内相对标准偏差≤１５％,批间相对标准偏差≤２０％. ５ GB３１６５８􀆰２８—２０２５ 附录 A (资料性) 乙酰孕激素类化合物信息乙酰孕激素类化合物的中英文名称、CAS号、化学分子式及相对分子质量参见表A􀆰１. 表A􀆰１ 乙酰孕激素类化合物标准物质的信息序号中文名称英文名称 CAS号化学分子式相对分子质量 １ 醋酸氟孕酮 Flurogestoneacetate ２５２９Ｇ４５Ｇ５ C２３H３１FO５ ４０６􀆰４８８ ２ 醋酸甲地孕酮 Megestrolacetate ５９５Ｇ３３Ｇ５ C２４H３２O４ ３８４􀆰５２ ３ 醋酸美仑孕酮 Melengestrolacetate ２９１９Ｇ６６Ｇ６ C２５H３２O４ ３９６􀆰５１９２ ４ 醋酸氯地孕酮 Chlormadinoneacetate ３０２Ｇ２２Ｇ７ C２３H２９ClO４ ４０４􀆰９３ ５ 醋酸羟孕酮 Hydroxyprogesteroneacetate ３０２Ｇ２３Ｇ８ C２３H３２O４ ３７２􀆰５ ６ 醋酸甲羟孕酮 Medroxyprogesteroneacetate ７１Ｇ５８Ｇ９ C２４H３４O４ ３８６􀆰５３ ６ GB３１６５８􀆰２８—２０２５ 附录 B (资料性) 乙酰孕激素类６种药物标准溶液定量离子色谱图乙酰孕激素类６种药物标准溶液(浓度为１０ng/mL)定量离子色谱图见图B􀆰１至图B􀆰６. 图B􀆰１ 醋酸氟孕酮(FGA)标准溶液定量离子色谱图(RT＝２􀆰０１min) 图B􀆰２ 醋酸甲地孕酮(MA)标准溶液定量离子色谱图(RT＝３􀆰４２min) ７ GB３１６５８􀆰２８—２０２５ 图B􀆰３ 醋酸美仑孕酮(MGA)标准溶液定量离子色谱图(RT＝３􀆰５６min) 图B􀆰４ 醋酸氯地孕酮(CMA)标准溶液定量离子色谱图(RT＝３􀆰３０min) ８ GB３１６５８􀆰２８—２０２５ 图B􀆰５ 醋酸甲羟孕酮(MPA)标准溶液定量离子色谱图(RT＝３􀆰５１min) 图B􀆰６ 醋酸羟孕酮(HPA)标准溶液定量离子色谱图(RT＝３􀆰１３min) ９